1.亲和层析技术的原理
亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。
2.亲和层析的常用标签
| 标签 | 纯化用的填料或配基 | 洗脱方法 |
| 多聚组氨酸（His） | 鳌合镍、铜、钴离子的填料 | 咪唑或降低pH |
| 谷胱甘肽硫转酶（GST） | 键合谷胱甘肽的亲和填料 | 10-20mM还原谷胱甘肽 |
| 麦芽糖结合蛋白（MBP） | 淀粉琼脂糖凝胶 | 麦芽糖 |
| 金黄色葡萄球菌蛋白A | IgG琼脂糖凝胶 | 低pH |
| Flag | anti-Flag | 低pH |
| 多聚苯丙氨酸（Poly-Phe） | 苯基琼脂糖凝胶 | 乙二醇 |
| 钙调蛋白结合肽 | 钙调蛋白 | EGTA |
| 纤维素结合域 | 纤维素 | 盐酸胍或脲 |
| 几丁质结合域 | 几丁质 | 巯基乙醇，半胱氨酸 |
3.亲和层析的纯化介质及其作用原理
3.1 his标签蛋白纯化
his标签常用的纯化填料有3种：Ni-IDA Purose 6 Fast Flow最大的优点是载量高，动态载量可达40-50mg/mL，价格也非常实惠；当然缺点也明显，Ni离子会有一定程度的泄露，纯化后的蛋白纯度也不算太高；
Ni-NTA Purose 6 Fast Flow不仅纯化纯度较高，通过控制合理的Ni离子密度，动态载量也达到了IDA的水平，动态载量仍然达到40-50mg/mL，Ni离子更加的稳定；
Ni-TED Purose 6 Fast Flow是一款应时代需要而开发的新生代产品，主要是解决EDTA和DTT耐受问题。强力的螯合配基TED与Ni离子形成5个螯合位点，这与EDTA与Ni的螯合类似（EDTA尽管有6个螯合位，但一般与Ni的螯合也是5个位点），因此Ni离子异常稳定，其螯合后的颜色也变成了更深的蓝色。(详询电话/微信:刘杨18696113991）
这款产品可以耐受10 mM EDTA和 5 mM DTT 长达24h，或者耐受100 mM EDTA 1h，并且不需要去Ni就可以直接用氢氧化钠洗去杂蛋白，很适合于样品液中需要添加EDTA和DTT来稳定蛋白的体系，动态载量可达10-20mg/mL。因为与His6 配位键的减少，该载量相比于IDA和NTA相应低一些，但已属很高水平。(非常适合原核表达体系中有还原剂或者DTT，酵母表达、CHO细胞表达、昆虫杆状病毒表达体系的蛋白纯化）
3.2 GST标签蛋白纯化
使用千纯生物GSH Purose 4 Fast Flow介质纯化GST标签融合蛋白,其谷胱甘肽转移酶与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
3.3 MBP标签蛋白纯化
作为融合蛋白的标签，通常放在 N 端在大肠杆菌中进行表达。MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达，尤其对于难表达的真核细胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表达能力，MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行， 使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP 标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除， 常用的内切酶是 Factor Xa，麦芽糖酶和肠激酶。
3.4 IgG纯化
iProtein A Purose 4 Fast Flow和iProtein G Purose 4 Fast Flow是常用的IgG的纯化填料，通过一步纯化就可以得到95%左右纯度的IgG;填料偶联的配基蛋白经过了修饰改造，保留了与IgG高结合域，去掉了非主要结合域，降低的非特异性吸附
3.5FLAG标签蛋白纯化
FLAG标签是由8个氨基酸（DYKDDDDK）组成的一个短肽，分子量很小，因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗体检测；同时含有一个肠激酶切割位点（DDDK），可以利用肠激酶切除标签。可以通过偶联了anti-FLAG单抗的介质纯化，成本高，不适用于大规模纯化
4.常用于稳定蛋白的添加剂
| 类型 | 功能 | 常用试剂 |
| 还原剂 | 防止氧化 | β-巯基乙醇 |
| DTT | ||
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine(TCEP) | ||
| 蛋白酶抑制剂 | 防止内源性蛋白酶分解蛋白 | 亮抑肽酶（丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂） |
| 抑胃肽（天冬氨酸蛋白酶抑制剂） | ||
| PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂） | ||
| 金属鳌合剂 | 是金属蛋白酶失活 | EDTA、EGTA |
| 精氨酸激酶 | 稳定蛋白质结构，增强溶解性 | 丙三醇 |
| 去污剂（如CHAPS、NP-40、Triton X-100） | ||
| 糖（如葡萄糖、蔗糖等） | ||
| 离子稳定剂 | 增强溶解性 | 盐类如Nacl、kCI、（NH4）） |
5.亲和纯化蛋白的注意点
5.1 Ni柱进行蛋白纯化时注意点：
(1)避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，等等；
(2)各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA和浓度的强还原剂，比如DTT等；（可以使用千纯生物Ni-TED Purose 6 Fast Flow）
(4) 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；
(5)在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；
(6)缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）
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最后编辑时间为: 2020-04-06 02:43 Monday
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