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记得很多年前我讲课时问大家：双试剂好还是单试剂好？，得到了异口同声的回答是：双试剂好！这之前我和很多业界前辈、技术同行交流过类似的问题，当我我和大家开玩笑的说：答案是卖什么就说什么好！！！其实我想表达的意思是各有各的好，合适就是最好。比如有些低端的生化分析仪试剂位有限，用双试剂时工作效率会下降。再比如，AU480只有一个试剂臂，双试剂虽然不影响工作效率，比如做一百个测试单试剂情况下试剂臂动100次而双试剂的情况下试剂臂要动作200次，我们在临床维修中试剂臂比样品臂出故障的机会大。

再从另外一个角度聊，如果我可以做成单试剂，分开两瓶谁不会啊？如果我单试剂的性能和双试剂一样，里面的技术含量一定比双试剂高不少呢，对吗？还有就是有些项目没有必要做成双试剂的，具体项目我就不说了。

我今天在这里是讲双试剂的，他如果和仪器很好有机的配合，可以发挥出巨大的能量。我们由浅入深一步一步把它说透。

一.双试剂终点法：我们上一期讲了双波长可以扣除黄疸溶血&乳糜血的干扰，但是，不同的双波长设定对干扰物的克服程度不同，克服黄疸就无法克服溶血，要看这个项目最怕什么干扰，而且双波长选错了以后还会出现【该死的双波长】问题。接下来说终点法双试剂，试剂一通常是缓冲液，不参与反应，这个时候如果标本有了颜色的干扰（溶血、黄疸、乳糜），在加入试剂二前做一个空白，就可以有效的消除干扰，起到了样品空白的作用。那么双试剂可以解决一切问题吗？当然不能，比如，早期的OCPC法的钙试剂，单试剂溶血标本明显偏高，双试剂就没问题，但是由于OCPC法远远不及现在的偶氮三砷法的单试剂钙稳定，这个方法基本被废除，单试剂的偶氮三砷法的钙不怕溶血的干扰，没有必要做成双试剂（因为OCPC法钙测定波长受溶血干扰，偶氮三砷法钙测定的波长和溶血没有交叉）。

像K/Mg/AST/LDH等项目，红细胞破坏以后里面含有这些成分，双试剂双波长都没有效果。

另外，双试剂终点法还有如下好处：目前临床多用的Trinder反应（多用于代谢物的测定），虽然很多公司优化了底物，但还是会受到胆红素和抗坏血酸（Vc）的干扰，很多公司在试剂一中加入抗坏血酸氧化酶，就能大大消除这种干扰。（临床中常见的尿酸偏低，血糖偏低要可虑这种因素）

下面以甘油三脂为例：

                      脂肪酶

甘油三脂--------------------甘油+游离脂肪酸

                   甘油激酶

甘油+ATP-------------------甘油-3-磷酸+ADP

                             甘油-3-磷酸氧化酶

甘油-3-磷酸+O2-------------------------------磷酸二羟丙酮+H2O2

                                     过氧化物酶

H2O2+4-AAP+ESPAS----------------------醌亚胺+H2O

在试剂一中加入：抗Vc氧化酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、 过氧化物酶，有Vc会被氧化，标本中如果有游离甘油会被消耗并作为本底，试剂二加入脂肪酶，扣除加试剂一前的空白，就得到了真正的甘油三脂的结果。（题外话：TG的试剂里面含有2000U/L的脂肪酶，所以在携带污染里面TG非常影响脂肪酶的测定）。

二.双试剂速率法测定酶，这个例子最初由单试剂转变成双试剂最多试剂销售讲给客户了，我们今天拿出来复习一下，首先看看反应方程式：

                                       ALT

L-丙氨酸+a-酮戊二酸--------------------丙酮酸+L-谷氨酸

                                     LDH

丙酮酸+NADH-----------------------------乳酸+NAD+H2O

糖尿病的病人会出现酮症酸中毒，丙酮酸会升高，如果是单试剂这样会间接的影响ALT的测定。设计成双试剂后试剂一里面不含a-酮戊二酸，标本和试剂一混合以后会消耗掉外源性丙酮酸，加入试剂二（a-酮戊二酸），丙酮酸的影响被大大降低了。（大家看到了吗？这个试剂里面含有LDH，大约2000U/L，为什么不会出现ALT影响LDH的问题呢？答案是LDH的正常值范围很大，影响一点看不出来）。

三.双试剂速率法测定底物，以没法尿素（Urea）为例，介绍双试剂抗干扰的情况：

                       脲素酶

尿素+H2O---------------------2NH₄^＋+CO2

                                                 GLDH

NH₄^＋+α酮戊二酸+NADH-----------------------谷氨酸+NAD+CO2

1）如果标本中有内源性的NH₄^＋（比如肝昏迷），会引起测定结果偏高；

2）外源性的NH₄^＋，比如水机出现故障，也会造成结果偏高；

3）内源性的酶（比如血液中的LDH），在标本丙酮酸比较高的情况下，会与GLDH竞争氧化NADH从而造成测定结果的阳性偏差；如果设计成双试剂，标本和R1（α酮戊二酸，NADH，GLDH），先去除NH₄^＋及酶（LDH、丙酮酸）的干扰，再加入试剂2（脲素酶）启动真正的反应。

四.以苦味酸法的肌酐解释双速率法：酶法肌酐的出现使苦味酸法的肌酐处于淘汰的边缘，我们今天是以这个例子讲清楚原理。

                            碱性环境

苦味酸+肌酐----------------------红橙色化合物

临床上为了减少假肌酐的干扰，利用假性肌酐反应比较慢这一特点，采用初始速率法。但此方法易受胆红素（某些标本或高值质控的胆红素含量较高）的干扰，因为碱性环境（氢氧化钠）能氧化胆红素成胆绿素（此反应比较慢，不能瞬间完成），在肌酐的测定波长520nm可以看到吸光度的下降，用双速率法（Double Rate Assay）可以克服这个干扰。

五.以CK-MB为例继续解释双速率法：CK-MB目前存在的问题是复合质控中没有这个项目需要单独订购，第二，非常受到标本存放时间（不是CK-MB不稳定，是因为时间长了干扰增加）和溶血的干扰（尤其是儿童，当小孩怀疑心肌炎测定CK-MB的结果通常是高的），以致于CK-MB这个项目被免疫方法代替的境地，实际上如果使用双速率法，就能排除干扰，这个我们在临床上积累大量的经验。

                              CK

磷酸肌酸+ADP----------------肌酸+ATP

                              HK

ATP+葡萄糖-----------------------葡萄糖-6-磷酸+ADP

                                  葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

葡萄糖-6-磷酸+NADP--------------------------------6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H^＋

这个是CK-MB的反应方程式，腺苷酸激酶（ADK）会影响这个反应，ADK存在于肝、肾、红细胞、血小板中，RBC中并没有CK-MB，但是却含有ADK，所以溶血会有正干扰，大家试一试，如果没有分离胶的试管，在冰箱里面过夜（因为红细胞膜的通透性改变，ADK释放到血清中），再次复查CK-MB偏高的概率会非常大。

我们分析一下ADK的干扰反应：

                     ADK

2ADP-------------------------ATP+AMP

大家结合上面的反应方程式分析，如果标本中存在少量ADK，ADP是第一步反应的底物，在没有CK和磷酸肌酸的作用下，ADP就能转化出ATP，从而向下进一步发生反应。

一般的试剂厂家会在试剂中加入ADK的抑制剂AP5A（五磷酸二腺苷）来抑制ADK的干扰，但是抑制率只有95-97%，AP5A加多了会抑制CK的反应。也就是说还有3-5%的没有被抑制，对于正常的标本会升高0-6U/L，极端的标本会影响非常高，应用双试剂速率法，试剂一中什么都含有（包括激活剂镁离子）唯独不含有磷酸肌酸，加入标本后产生的吸光度变化就是干扰反应，加入试剂二后是两个反应的合反应，双速率法可以有效消除这种干扰。下面是示意图：

下面这个图是很多年前我记录的。

大家看看吸光度在十点以前是逐渐上升的。

0.1127--0.1137--0.1146--0.1155--0.1165逐渐上升。

总结：现在市面上的CK-MB多为液体双试剂，因为Mg离子的加入会影响试剂的稳定性，目前在售的液体双试剂均没有此功能。

来源：打开维修之门

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最后编辑时间为: 2020-03-09 23:57 Monday