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    液相色谱中应用最广泛的是反相色谱，反相色谱的定义是流动相极性大于固定相，但是对于极性化合物在反相色谱中分离存在两个主要的问题，一是化合物不保留或保留很差，二是由于存在次级保留效应，峰形很差。解决这个问题可以参考以下思路解决：

一．         向流动相中加入改性剂抑制分析物的电离，例如有机弱酸和弱碱在流动相PH为7的时候，容易电离，流动相加入酸（甲酸、乙酸、三氯乙酸、磷酸或硫酸等）或碱（三乙胺等）可以抑制目标化合物的离子化，增加保留。以下通过反相色谱分离咖啡酸、阿魏酸和异阿魏酸的例子来说明，色谱条件为KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，乙腈-水-磷酸（13:87:0.5，V/V/V）,流速为1.0mL/min,柱温35℃，紫外检测器320nm下得到图二的色谱图。

图二.咖啡酸（a）、阿魏酸（b）、异阿魏酸（c）色谱图

二．         利用反相离子对色谱（RPIPC），反相离子对色谱把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电荷的中性离子，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。RPIPC可用于分离多种分子量大的阴阳离子，主要包括：大分子量脂肪酸、阴离子和阳离子表面活性剂、季铵化合物、芳香磺酸盐和芳香硫酸盐、季铵化合物、水溶性维生素和烷醇胺等。

离子对试剂一般是包含与固定相作用的疏水区和与被分析离子作用的亲水性电荷区的较大的离子型分子，常用的离子对试剂有两种，一种是用于酸性样品分离的季铵盐型试剂（PICA）,用于碱性化合物分离的烷基磺酸盐（PICB）。典型的例子是三聚氰胺的检测：图三的色谱条件为KromasilC8(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱50%乙腈水溶液-庚烷磺酸钠（0.01mol/L,PH为3.3）（15:85，V/V），流速为1.0mL/min,柱温40℃，紫外检测器236nm.

图三.三聚氰胺色谱图

三．         利用柱前衍生来实现，通过柱前衍生使目标化合物转变成能在反相色谱中保留的化合物来实现分离分析的目的。例如多种氨基酸的分析，氨基酸的柱前衍生有多种衍生剂，常用的有邻苯二醛（OPA）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）、异硫酸苯酯（PITC），现在也有商品化的氨基酸柱前衍生试剂包，

下图是采用PITC为衍生化试剂来测定阿胶中的13种氨基酸，色谱条件为AgilentEclipse AAA 色谱柱（75 mm×4.6mm，3.5μm）；以乙腈-110mmol/L 乙酸铵溶液（1∶99）为流动相A，以乙酸-乙腈-水（0.05∶80∶20）为流动相B，进行梯度洗脱，0min，4% B；2～4 min，9% B；9 min，10% B；12min，12% B；15min，22% B；24min，23% B；27min，29% B；31～36min，100%B；紫外检测波长为254nm；流速为0.6mL/min。

图四. 衍生氨基酸色谱图

（1-天冬氨酸 2-谷氨酸 3-羟脯氨酸 4-甘氨酸 5-组氨酸 6-精氨酸 7-丙氨酸 8-脯氨酸 9-缬氨酸 10-异亮氨酸 11-亮氨酸 12-苯丙氨酸 13-赖氨酸）

参考文献

1. 司丹丹，李清，陈晓辉，等.RP-HPLC法同时测定升麻中三种有机酸的含量[J].沈阳药科大学学报，2007,24(12): 754-754.

2. 杨云霞，刘彤，周桂英，等.小麦谷元粉中三聚氰胺的高效液相色谱法测定[J].分析测试学报2008,27(3): 322-324

3. 陈萍红，王书芳，龚行楚.柱前衍生RP-HPLC法测定阿胶中13种氨基酸[J].中草药，2013,43(14): 1995-1999

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最后编辑时间为: 2020-06-08 02:12 Monday