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摘 要：目的  研究黄芩秋季采收期药效成分的动态变化及生态因子和关键酶表达对其的影响。方法  以人工栽培的一年生黄芩为研究对象，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定秋季连续时间黄芩根组织中9种关键酶基因（PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FNS、F6H、UBGAT、GUS）的表达量；采用HPLC法测定黄芩根中4种主要黄酮类化合物（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）的含量；以生态气象站对黄芩样地气象数据进行采集；采用SPSS统计软件和DPS统计软件进行数据分析。结果 4种黄酮类化合物含量在一年生黄芩秋季呈缓慢下降的趋势，因此黄芩秋季最佳采收时间应在9月初；灰色关联度分析结果表明影响4种黄酮类药效成分较大的生态因子为土壤含水量、最高空气温度、空气湿度、光合有效辐射；C4H、UBGAT基因的表达对黄芩秋季根部黄酮类化合物的积累具有重要影响；最大降雨强度可能通过对关键酶基因表达的影响来间接影响黄芩药效成分的积累。结论  明确了一年生黄芩秋季采收期4种主要黄酮类药效成分的动态变化和黄酮类化合物关键酶基因的表达，为黄芩黄酮类化合物合成生理生态机制的明晰和黄芩药材质量的提高提供了理论依据。

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi为唇形科多年生草本植物，中药黄芩是其干燥根^[1]，具有清热燥湿、泻火解毒和止血安胎的功效^[2]。黄芩的主要药效成分是黄酮类化合物，其中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素等是主要活性成分，也是黄芩及其制剂的主要质量控制指标^[3-5]。

影响药材质量的因素是十分复杂的，除环境因素外，遗传也是造成药材活性成分含量差异的主要因素^[6]。目前黄芩苷等活性成分的生物合成途径已取得较大进展^[7]，其生物合成途径包括多步酶促反应，关键酶有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、桂皮酸-4-羟化酶（C4H）、香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、查耳酮合成酶（CHS）、查耳酮异构酶（CHI）、黄酮合成酶（FNS）、黄酮类-6-羟化酶（F6H）、黄芩素- 7-O-葡萄糖醛酸基转移酶（UBGAT）和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）等。虽然已经从黄酮类化合物生物合成途径中发掘出多个关键酶基因，但这些基因的表达对黄酮类合成的调控机制尚不清晰，有关生态因子对黄酮类化合物合成关键酶基因表达影响的研究还比较少。中药材的药效成分质量除了受遗传因子的调控和环境条件的影响外，采收期也是十分重要的因素^[8-9]，研究表明，从药效成分含量方面考虑，黄芩的最佳采收期为秋季^[10-12]，从植物学来说秋季更适宜采收黄芩^[13]，而秋季药效成分的系统变化情况还未见研究报道。

本研究以一年生黄芩根组织部位为材料，并选择已经得到功能验证的9种黄酮类化合物合成关键酶基因（PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FNS、F6H、UBGAT、GUS），对黄芩秋季连续时间的表达量进行测定，测定了黄芩根中的4种单体黄酮类化合物（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）在不同生长时间的含量变化、采集了黄芩样地气象数据，包括光合有效辐射（PAR）、降雨量、最大降雨强度、空气湿度（RH）、土壤含水量（SWC）、土壤温度、空气温度（Ta）、最大空气温度（Max Ta）、最低空气温度（Min Ta），分析了生态因子对黄芩黄酮类化合物积累及其关键酶基因表达的影响，为指导黄芩秋季采收和黄芩药材质量的提高提供理论依据。

1  材料与仪器

1.1  材料

试验点设在吉林省长春市吉林农业大学药用植物园（N：43°48′24″，E：125°24′59″），供试黄芩种子源自吉林农业大学药用植物园，经吉林农业大学中药材学院韩梅教授鉴定为唇形科黄芩属黄芩Scutellaria baicalensis Georgi，于2016年9月23日播种，播种密度行距20 cm，株距5 cm，样地长35 m，宽10 m，样地面积350 m²，生长期间田间管理水平相同。2017年9月1日—10月31日取样，平均每5天取样1次，采样原则为“五点取样法”，即在种植地块选择5个区域进行取样，每个区域取1株完整样品。将供试黄芩样品置于冰盒中保鲜，带回实验室后迅速洗净，吸水纸吸干，部分根组织切成小块置于冻存管，使用液氮对样品进行快速冷冻，贮存于−80 ℃超低温冷藏箱以用于后续实验，剩余样品置于烘箱中60 ℃烘干至恒定质量，用粉碎机磨成细粉，过60目筛，以备用。

1.2  试剂与仪器

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、BiotekeSuper RT Kit cDNA合成试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）；NanoPhotometer P330核酸/蛋白定量仪（Implen公司，德国）、ProFlex^TM Base梯度PCR扩增仪（Applied Biosystems公司，美国）、Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪、1260型高效液相色谱仪（Agilent公司，美国）、ENVIDATA-Thies科研级生态气象站（北京澳作生态仪器有限公司）；对照品黄芩苷（批号919D022，质量分数≥98%）、汉黄芩苷（批号823B022，质量分数≥98%）、黄芩素（批号1209A024，质量分数≥98%）和汉黄芩素（批号1025A022，质量分数≥98%）购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇（色谱纯，Fisher Scientific公司），磷酸（色谱纯）、乙醇（分析纯）购于北京化工厂。

2  方法

2.1  黄芩采样地气象数据的采集 

于2016年5月9日将ENVIDATA-Thies科研级生态气象站安装于吉林省吉林农业大学药用植物园观测自然条件下黄芩采样地环境因子变化，进行24 h数据的采集，每0.5 h自动收集数据1次，包括PAR、降雨量、最大降雨强度、RH、SWC、土壤温度、Ta、Max Ta、Min Ta，并对实验数据进行统计分析。

2.2  黄芩根部次生代谢关键酶基因表达量的测定 

取黄芩根组织样品在液氮中研磨成细粉，根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作步骤提取总RNA，采用NanoPhotometer P330核酸/蛋白定量仪测定总RNA浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。根据Bioteke Super RT Kit cDNA合成试剂盒的操作步骤将总RNA逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，根据各基因的引物序列^[13-14]分别对黄芩PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FNS、F6H、UBGAT、GUS基因进行RT-PCR扩增，重复4次。qRT-PCR反应的内参基因为18 S rRNA，运用公式2^−ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。RT-PCR反应体系：灭菌水8 μL，SYBR^®Premix Ex Taq^TM II10 μL，引物各1 μL，cDNA模板1 μL，总计20 μL。qRT-PCR反应程序：94 ℃预变性30 s，40个循环（95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s）。

2.3  黄芩根部主要药效成分的测定^[14] 

2.3.1  对照品溶液的制备  精密称取黄芩苷12.24 mg，汉黄芩苷2.86 mg，黄芩素1.43 mg，汉黄芩素1.28 mg，乙醇超声溶解并分别定容至10、10、10、25 mL，配制成质量浓度分别为1.20、0.28、0.14、0.05 mg/mL的对照品溶液，置4 ℃冰箱保存备用。

2.3.2  供试品溶液的制备  精密称取不同生长时段的黄芩样品0.100 g，加入5 mL 70%乙醇超声提取30min，重复提取3次后合并滤液，70%乙醇定容至25 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过得检测溶液。

2.3.3  色谱条件^[15]  Agilent Eclipse XDB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，DAD检测器，流动相为甲醇（A）-0.4%磷酸水（B）溶液，梯度洗脱，洗脱梯度程序：0～18 min，48%～65% A；18～25 min，65% A；25～26 min，65%～100% A；26～32 min，100% A。进样量10 μL，检测波长284 nm，体积流量1.0 mL/min，分析时间32 min，柱温25 ℃，分离色谱图见图1。

2.3.4 线性关系考察  分别吸取各对照品溶液适量，稀释，得系列质量浓度的对照品溶液。精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.3.3”项色谱条件进行测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归处理，得各黄酮类化合物单体回归方程：黄芩苷Y＝2 626.76 X－96.09，R²＝0.9997，进样质量浓度在55～578 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系；汉黄芩苷Y＝2 578.67 X－35.09，R²＝0.9995，进样质量浓度在11～134mg/mL与峰面积呈良好的线性关系；黄芩素Y＝4 517.88 X－1.91，R²＝0.9996，进样质量浓度在5～67 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系；汉黄芩素Y＝4 434.29 X－4.67，R²＝0.9993，进样质量浓度在2～21 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5  样品的测定  取各供试品溶液根据以上方法检测并计算供试品溶液中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量。

2.4  数据处理

测定数据应用SPSS 22.0统计软件进行Pearson相关性分析，DPS v7.05统计软件进行灰色关联度分析，Microsoft Excel 2010软件绘图制表。

3  结果与分析

3.1  黄芩采样地气象数据

将科研级生态气象站采集的气象数据统计平均值，对取样样地一年生黄芩物候期进行观察，根据黄芩生长发育特点将果熟期和枯萎期分别确定为8月26日～10月5日、10月6日～11月5日。黄芩采样地各生长时段生态因子差异见表1，该样地生态因子在不同时间段变化明显。整体PAR呈下降趋势，9月2日～9月5日、10月7日～10月11日较低。果熟期平均PAR [107.875 μmol/(m²∙s)]约是枯萎期[54.339 μmol/(m²∙s)]的2倍。降雨主要集中在果熟期，采样阶段降雨量平均为0.496 mm，果熟期为0.786 mm，8月28日、9月5日～9月11日、9月22日～9月27日降雨量比较多，枯萎期降雨很少，平均降雨量仅为0.060 mm。整体RH呈“M”型曲线，缓慢下降，降幅较小，果熟期平均62.980%，枯萎期平均54.552%，9月26日～10月7日较低。SWC整体缓慢平稳下降，果熟期平均30.903%，枯萎期平均27.596%。土壤温度整体呈下降趋势，最高平均温度21.391 ℃，最低平均温度7.686 ℃。空气温度整体呈匀速下降趋势，果熟期平均温度（15.399 ℃）约是枯萎期（7.272 ℃）的2倍。

3.2  黄芩根部次生代谢关键酶基因表达量的测定

利用qRT-PCR方法，以18 S rRNA作为内参基因，检测一年生黄芩根组织中PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FNS、F6H、UBGAT、GUS基因在黄芩不同生长时间的表达量，结果见图2。

一年生黄芩根中关键酶基因的表达量在不同生长时间存在明显差异。不同生长时间黄芩PAL基因在根中的表达量9月1日最高，9月1日～11日快速下降，9月11日表达量约为9月1日表达量的4.19%，9月16～21日有所回升，之后整体呈下降趋势，10月31日表达量最低。黄芩C4H基因在根中的表达量9月5日突然升高至最高，之后除10月6日表达量有所回升，整体表达量呈缓慢下降的趋势。在不同生长时段4CL、CHS基因的表达量9月1～21日呈上升的趋势，9月21日表达量最高，9月21日～10月1日表达量迅速下降，之后虽然10月初期有所回升，但整体上是呈缓慢下降的趋势。在不同生长时段黄芩CHI基因的表达量整体呈先升高，再下降的趋势，9月21日表达量达到最大值，10月31日表达量最低，期间9月5日、10月1日表达能力相对较弱。FNS基因在根中的表达量9月1日很高，9月5日突然降到很低，9月11日有所回升，之后虽然10月初期有所回升，但整体上呈缓慢下降的趋势。黄芩F6H基因的表达量9月5日、9月16日、9月21日较高，其余时间呈缓慢下降的趋势，10月31日表达量最低，10月31日表达量大约是9月1日表达量的11.02%。在不同生长时段黄芩UBGAT基因在根中的表达量从9月1～21日呈上升趋势，9月21日表达量最高，但期间9月5日表达量很低，之后变化幅度变化较大。黄芩GUS基因的表达量9月1日最高，9月5日突然降低，之后虽然9月16日、10月6日有所上升，但整体趋势是缓慢下降的，10月31日几乎不表达。

3.3  黄芩根部主要药效成分的测定结果

一年生黄芩根中4种单体黄酮类化合物变化如图3所示，一年生黄芩根中4种主要单体黄酮类化合物含量由大到小分别为黄芩苷＞汉黄芩苷＞黄芩素＞汉黄芩素。4种单体总黄酮在黄芩的不同生长时间变化趋势并不相同：一年生黄芩根中黄芩苷含量整体上呈下降的趋势，9月1日黄芩苷含量最高，从9月1日～10月6日的果熟期下降较快，期间10月1日已降到《中国药典》2015年版规定含量（不少于9%）以下（8.92%），之后到了枯萎期，虽然10月6～21日有所上升，但整体上还是呈缓慢下降的趋势，10月31日黄芩苷含量达到最低，10月31日黄芩苷含量约是9月1日黄芩苷含量的53.94%。黄芩根中汉黄芩苷含量在不同生长时间变化不大，质量分数在1.50%～2.70%浮动，虽然9月27日有所上升，但整体上在非常缓慢地下降。一年生黄芩根中黄芩素含量9月1～21日缓慢上升，9月21日黄芩素含量最高，9月27日突然下降，之后虽然10月1日有所回升，但整体上呈缓慢下降的趋势，10月26日黄芩素含量最低，10月26日黄芩素含量约是9月21日黄芩素含量的14.60%。汉黄芩素含量9月1日～10月11日缓慢上升，期间只在9月27日有所下降，10月11日汉黄芩素含量达到最大值，为0.38%，之后缓慢下降，10月26日降到最低，为0.05%。

3.4  黄芩根部关键酶基因表达与生态因子和主要药效成分的相关性分析

黄芩不同生长时间生态因子与黄芩根部关键酶基因表达量的相关性分析结果见表2，从表2中可知，PAR与PAL基因的表达有极显著的促进关系（P＜0.01），PAR也可以显著提高CHI、FNS、GUS的表达量（P＜0.05），说明适当增加光照可能是提高黄芩药材质量的有效方式之一。C4H基因的表达与降雨量表现出了极显著的相关性（P＜0.01），最大降雨强度与C4H、F6H呈极显著相关（P＜0.01），与UBGAT呈显著负相关（P＜0.05），可以看出强降雨对关键酶基因的表达具有有效的促进作用。RH与4CL、CHS基因的表达有极显著的相关性（P＜0.01），与F6H基因的表达也具有显著的相关性（P＜0.05），另外，SWC对PAL、FNS、GUS基因的表达具有极显著的促进作用（P＜0.01），因此适当提高空气湿度和土壤中的含水量也可能是提高黄芩药材质量的重要手段之一。土壤温度与4CL、CHS基因的表达表现出了极显著的相关性，与C4H、CHI、F6H 基因的表达相关性显著（P＜0.05），说明土壤温度对可能黄芩质量提高的影响重大。Ta与4CL、CHS基因的表达具有极显著的相关性（P＜0.01），与CHI、F6H基因的表达相关性显著，最高、低空气温度对该4个基因也具有显著的相关性。

黄芩不同生长时间生态因子与黄芩根部主要药效成分相关性分析结果见表3，从本研究结果显示生态因子与黄酮类化合物均具有显著的相关性，说明这些生态因子与黄芩药效成分的积累关系密切。PAR与空气温度对黄芩苷、黄芩素的合成与积累均表现出了显著正相关，因此适当地增强光照，提高温度可有效提高黄芩根部药效成分质量；降雨、RH对黄芩苷的合成有显著的促进作用（P＜0.05），而对其他药效成分并未达到显著水平，降雨、RH未直接作用于根部，因此对黄芩药效成分的合成并影响较小；最大降雨强度对4种黄酮类化合物并没有显著相关，说明最大降雨强度对黄芩药效成分的合成影响不大。SWC与黄芩苷的合成呈极显著正相关（P＜0.01），与汉黄芩苷、黄芩素的合成呈显著相关（P＜0.05），说明适当提高土壤含水量对黄芩根部药效成分的合成具有重要作用；土壤温度与黄芩苷、黄芩素呈极显著相关（P＜0.01），与汉黄芩苷呈显著相关（P＜0.05），因此土壤温度与黄芩药材质量的高低密切相关。

黄芩根中关键酶基因表达量与4种主要药效成分相关性分析结果见表4，黄芩根部PAL基因与黄芩苷、汉黄芩苷呈显著相关（P＜0.05），因此PAL基因是黄芩根部黄酮类化合物生物合成途径中的关键元件之一。黄芩素与CHS基因的表达量呈极显著正相关（P＜0.01），与4CL、CHI基因的表达量呈显著相关（P＜0.05），从表中还可看出4CL、CHS、CHI基因对黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的合成也具有较强的正向影响，说明黄芩生物合成途径中游4CL、CHS、CHI基因表达量的提高可有效提高黄芩药效成分质量。黄芩FNS、F6H、UBGAT和GUS基因位于黄芩生物合成途径中的下游，但是它们各自发挥着不同的功能，UBGAT基因对4种主要药效成分的合成表现出抑制作用，FNS、F6H、GUS基因对4种主要药效成分的合成则表现出正向影响，因此基因UBGAT表达量的降低、FNS、F6H、GUS基因表达量的提高对黄芩药效成分的积累也具有积极影响。

3.5  黄芩根部关键酶基因表达与生态因子和主要药效成分的灰色关联度分析

黄芩不同生长时间生态因子与黄芩根关键酶基因表达量的灰色关联度分析结果见表5，从表中可以看出，生态因子与关键酶基因表达量的灰色关联值均较高，说明这些生态因子与关键酶基因的表达关系密切。最大降雨强度是影响PAL基因的主导因子，灰色关联度达到0.600 1；Max Ta和SWC<sp

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最后编辑时间为: 2020-03-26 00:38 Thursday