杏耀黑内幕

摘要:三甲基对苯二酚-1-单乙酸酯（TMHQ-1-MA）是合成维生素E醋酸酯的有效中间体。通过三甲基对苯二酚二乙酸酯和醇之间的区域选择性酯交换生成三甲基对苯二酚-1-单乙酸酯（TMHQ-1-MA）的最佳生物催化剂被证明是米黑毛霉固定化脂肪酶。研究了溶剂，酰基受体，底物摩尔比，反应温度和搅拌速度对脂肪酶催化反应的影响。脂肪酶RM IM催化区域选择性酯交换的最佳条件是在底物摩尔比为1:1，在50 ℃下在MTBE /正己烷（3:7）中搅拌200转/分时实现的。在上述条件下，脂肪酶RM IM表现出较高的底物耐受性（底物浓度为1.06 M）。多次实验表明，脂肪酶RM IM在该反应条件下非常稳定。动力学实验分析表明，酶促反应符合乒乓双向机制，并具有正丁醇的抑制作用。

关键词：TMHQ-1-MA；区域选择性酯交换；维生素E醋酸酯；脂肪酶RM IM

1．引言

维生素E（α -生育酚）是一种有效的脂溶性抗氧化剂，能阻止自由基反应的传播[1,2]。此外，维生素E还被认为是生长和繁殖的必需营养素，具有维持正常渗透性、增强皮肤毛细血管阻力、改善血液循环和抗衰老的功能[3]。维生素E因其强大的功能，在饲料、医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用，且需求量日益增加[4]。

维生素E的的主要商业形式是乙酸乙酯衍生物。三甲基氢醌-1-单醋酸酯（TMHQ-1-MA）是有效合成维生素E醋酸酯的一种中间体[5]。目前，（全消旋）-生育酚的工业合成是基于三甲基氢醌（TMHQ）与异植物醇、植醇或其衍生物缩合，然后酰化成商业形式[6,7]。三甲基氢醌通常由昂贵的2，3，6-三甲基苯酚获得。TMHQ通常由价格昂贵的2,3,6-三甲基苯酚获得。或者，可以通过使用TMHQ-1-MA作为芳族起始材料代替TMHQ来合成（全消旋）-α-生育酚乙酸酯。用于该替代合成的TMHQ-1-MA可以从较便宜的β-异佛尔酮通过酮基异佛尔酮和三甲基二苯醌二乙酸酯（TMHQ-DA）获得，后者必须经过绝对区域选择性转化为TMHQ-1-MA，这很难通过化学方法实现。与TMHQ相比，以TMHQ-1-MA为起始原料进行的缩合反应是有利的，因为随后可以以直接的方式合成生育酚乙酸酯，这提高了原子经济性，并减少了反应步骤[4]。

近年来，酶法合成维生素E中间体因其具有高的区域选择性、温和的操作条件和环境友好性质而备受关注[8,10]。现已报道的TMHQ-DA在水饱和溶剂中可以通过选择性酶水解可制得TMHQ-1-MA。例如，嗜热杆菌脂肪酶（TLL）和荧光假单胞菌脂肪酶（PFL）在水饱和溶剂中，具有高区域选择性和转化率[4,5]。然而，从经济角度看，在已报道的专利中，脂肪酶催化TMHQ-1-MA生产的瓶颈是底物浓度相对较低以及反应速率较低。

本文旨在开发生物催化合成TMHQ-1-MA的方法。采用脂肪酶催化的TMHQ-DA与短链醇在有机溶剂中的区域选择性酯交换反应作为模型反应（方案1）。随后，系统地考察了生物催化剂性质、溶剂、酰基受体、底物摩尔比、反应温度、搅拌速度、底物浓度等反应条件对反应的影响，推导了反应机理和动力学。此外，还研究了酶的可重复利用性。

方案1. TMHQ-DA与醇的酯交换反应的一般反应过程

2. 材料与方法

2.1酶

脂酶435（CAL-B，由大孔聚丙烯酸酯树脂固定的南极念珠菌脂肪酶B，10000 u/g），脂酶RM IM（RML，离子树脂固定化的粘菌，20000 u/g），脂酶TLIM（TLL，T.阿诺霉素以硅胶固定，50000 u/g）由Novozymes a/s提供(丹麦Bagsvaerd)；从华科纯化工有限公司采购脂肪酶PS IM（PCL，硅藻土固定化的假单胞菌洋葱乳蛋白酶，30000 u/g）（日本大阪）；脂肪酶AK(PFL，P.荧光脂肪酶，20000 u/g，脂肪酶A（ANL，黑曲霉脂肪酶，12万u/g），脂肪酶AY（CRL，假丝酵母脂肪酶，70万u/g）。

2.2 化学试剂

TMHQ-DA是由浙江医药有限公司提供的（浙江（中国）有限公司）。本报告所使用的其他化学品属于分析级，从当地供应商购买。所有溶剂和反应物均用4 A分子筛预处理。

2.3 实验步骤

2.3.1脂肪酶催化TMHQ-DA酯交换的一般反应

在50 ml瓶装条件下，加入一定量的TMHQ-DA（0.42-10.59mmol）和乙醇（0.42-10.59 mmol）与0.05 g脂肪酶在10 ml有机溶剂中进行酯交换反应。反应混合物在C76水浴摇床中以100-300 rpm的搅拌速度范围和20-60 ℃的温度范围进行摇动。

2.3.2产品纯化

反应后，通过过滤分离固定化酶。将滤液在旋转蒸发器中在95 ℃减压浓缩20分钟。然后，通过加入乙醇（约为残余物体积的10倍）沉淀产物，然后在4 ℃下逐滴加入去离子水。

2.4 分析方法

通过气相色谱（Agilent 6890N，Aginent Technology，Avondal，PA，USA）进行分析，该仪器配有火焰离子化检测器（FID）和HP-5柱（30m×0.32mm×0.25m，Agilent Technologies，美国）。载气为氮气，入口流量为1ml / min，分流比为1:20。柱温保持在100 ℃，2 min，以10 ℃/ min升至180 ℃，并保持5 min。TMHQ-1-MA和TMHQ-DA的保留时间分别为12.3和13.6 min。

表1用于TMHQ-DAa酯交换的7种商用脂肪酶的性能

编号	酶	产率（%）b	区域选择性（%）
1	脂酶RM IM	99.14	100
2	脂肪酶PS IM	35.1	100
3	脂酶435	32.54	77.68
4	脂酶TLIM	16.36	100
5	脂肪酶AK	17.20	100
6	脂肪酶AY	0.69	100
7	脂肪酶A	-	-

a 在200 rpm和30 ℃下，分别以含有0.424 mmolTMHQ-DA和0.848 mmol正丁醇的10ml MTBE加入脂肪酶，进行了10 ml甲基叔丁基醚的反应，在6 h停止反应。

b 通过GC测定TMHQ-1-MA的产率。

3 结果与讨论

3.1 酶筛选

对于7种市售脂肪酶，包括4种固定化酶和3种酶粉，通过TMHQ-DA和短链醇之间的区域选择性酯交换，评估了它们对TMHQ-1-MA产生的能力。因此结果显示，除了脂肪酶 435之外，所有测试的脂肪酶都显示出对TMHQ-DA的绝对1'-区域选择性。脂肪酶 435的1'-区域选择性仅为77.68％。据杨等人的研究，在Novozym 435，脂酶 TL IM或脂肪酶 PS IM催化的熊果苷的丁酰化反应中具有优良的选择性[11]。因此，活动是唯一需要考虑的因素。如表1所示，观察到固定化脂肪酶对TMHQ-DA的活性高于脂肪酶粉末的一般规律性。其中一个可能的原因是天然酶很可能在非极性溶剂中聚集。在这些酶中，脂肪酶RM IM的活性最高（99.14%），在酯交换过程中没有检测到脂肪酶A（ANL）的活性。因此，选择脂肪酶RM IM作为TMHQ-DA合成TMHQ-1-MA的最佳生物催化剂。

3.2 溶剂效应

有机溶剂作为反应介质，对酶的活性有直接影响。有研究表明，固定化脂肪酶要保持酶的活性，必须要有适量少的水分。因此，与亲水溶剂相比，疏水溶剂更受青睐，因为亲水溶剂会导致酶周围必需的水层发生条纹[12-14]，这是酶活性所必需的。本文研究了各种溶剂对酶促反应的影响。结果表明，除了MTBE，其他在极性溶剂中产率和起始率均较低（Log P<2），，而Log P值在2-4范围内的溶剂有利于TMHQ-1-MA的合成。非极性溶剂（LogP>2）取代极性溶剂（LogP<2）酯交换产率较高，此结果与文献报道的结果相似[15-16]。正己烷的测井P值为3.764是本研究发现的最佳单溶剂，与其它溶剂相比，产率最高（表2）。

考虑到TMHQ-DA的溶解度、产率和溶剂毒性，考察了MTBE和正己烷混合溶剂对TMHQ-DA酯交换反应的影响。在相同条件下对MTBE与正己烷的不同体积比进行了研究，结果表明，MTBE与正己烷的体积比为3:7，产率最高（97.61%），初始率为2.28 mm/min，以3:7的MTBE和正己烷为溶剂进行了进一步的研究。

表2溶剂对TMHQ-DAa酯交换反应的影响

溶剂	Log Pb	溶解度(10−1g/ml)c	初始速度(10−1mM/min)d	产率（%）
乙腈	-0.33	5.88	0.07	0.19
THF	0.47	4.27	0.14	1.00
叔丁醇	0.58	0.56	0.64	4.19
MTBE	1.29	0.97	10.38	77.96
二氯甲烷	1.41	6.05	0.53	6.33
甲苯	2.72	2.73	12.18	79.67
环己烷	3.16	0.12	11.85	78.51
己烷	3.76	0.07	16.64	90.55
异辛烷	4.37	0.07	10.60	76.26
MTBE /己烷（3:7）	-	0.21	22.80	97.61

a 在含0.424 mmol TMHQ-DA和0.848 mmol正丁醇的10 ml不同溶剂中，用0.05g脂质酶RM IM在200 rpm和30 °C，1h(1 h停止反应)时，进行反应。

b 在25 °C处的log P数据引用了Scifinder学者的资料。

c 在30 °C下测定TMHQ-DA在不同溶剂中的溶解度。

d 初始反应速率根据产物的产率确定10％。

3.3 酰基受体的作用

在保持其它参数不变的情况下，研究了不同醇（甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇和正丁醇）对脂肪酶RMIM催化TMHQ-DA区域选择性酯交换反应的催化作用。如图1所示，TMHQ-DA与正丁醇的酯交换反应在前60 min的收率最高。与醇相比，2-丙醇的反应收率显著降低。进一步的研究表明，脂肪酶催化酯化反应和酯交换反应中醇链长度和类型的变化与产率的变化有关，而与脂肪酶RM IM的变性效应无关。在此基础上，选择正丁醇为最佳醇。

表3 底物摩尔比对TMHQ-DAa酯交换反应的影响

编号	底物摩尔比b	产率（%）
1	1:1	93.06
2	1:2	89.18
3	1:3	84.46
4	1:4	79.13

a 在10 ml甲基叔丁基醚/正己烷（3:7）（含0.424mmol TMHQ-DA和0.424~1.696mmol正丁醇）、0.05 g脂肪酶RM IM（200 rpm）和30 ℃（30 min）条件下进行反应。

b TMHQ-DA与正丁醇的摩尔比。

3.4 TMHQ-DA与正丁醇摩尔比的影响

正丁醇的加入对TMHQ-1-MA的合成有显著的影响。在保持TMHQ-DA摩尔比不变的情况下，研究了不同摩尔比TMHQ-DA与正丁醇在1:1~1:4范围内底物摩尔比对酯交换反应的影响。在TMHQ-DA：丁醇的摩尔比为1:1时，得到了最大产率和反应速率（表3）。进一步将底物摩尔比从1:2提高到1:4，降低了产率和反应速率。这可能与正丁醇对脂酶RM IM的抑制作用有关。该酶具有疏水性，正丁醇中含有疏水性尾和极性头。该酶与正丁醇之间可能存在疏水-疏水相互作用。

这种相互作用会增加正丁醇与酶的停留时间，导致部分脱水，从而破坏酶的固有构象，导致正丁醇的抑制作用[17]。因此，在高浓度的正丁醇与酶相互作用时，可以得出结论，正丁醇与酶相互作用，形成死区抑制复合物。以摩尔比1:1为最佳底物比。

图1.不同的酰基受体酯交换对TMHQ-DA的影响。反应条件：TMHQ-DA 0.424 mmol，酰基受体0.848 mmol，MTBE：正己烷（3：7）10ml，脂肪酶RM IM 0.005g / ml，温度30 ℃，搅拌速度200 rpm。符号：甲醇（方形）; 乙醇（圆形）; 正丙醇（正三角）; 2-丙醇（倒三角）; 正丁醇（菱形）

3.5 温度的影响

反应温度是影响酶催化反应的一个重要参数。本文研究了反应温度在20~60 ℃范围内对酯交换反应的影响。一般来说，在一定范围内提高反应温度可以加快起始反应速率，提高产率。相反，高温处理会破坏酶的三级结构，使其失活。在本研究中也取得了类似的结果（图2）。在20~50 ℃范围内，初始速率在2.381~4.254 mm/min范围内呈比例上升，但当温度进一步升高到60 ℃时，初始速率和产率只略有提高。考虑到溶剂的挥发性（甲基叔丁基醚的沸点：55.2 ℃）和酶的稳定性，在以下工作中选择了50 ℃。

3.6 搅拌速度的影响

搅拌速度影响反应体系中底物和产物的扩散和分配。在100~300 rpm范围内研究了搅拌速度对脂酶RM IM催化TMHQ-DA酯交换反应的影响。搅拌速度从100转提高到200转时，由于传质阻力的降低，反应速率显著提高。但是，在200rpm以下的反应速率没有明显变化。这可归因于在200 rpm以上的反应器壁上有一定数量的催化剂颗粒被从液相中抛出。因此，选择了200 rpm转速的搅拌速度。

图2.温度对TMHQ-DA酯交换反应和初始反应速率的影响。反应条件：TMHQ-DA 0.424 mmol，正丁醇0.424 mmol，MTBE：正己烷（3:7）10 ml，LipozymeRM IM 0.005 g / ml，搅拌速度200 rpm。符号：20 ℃（方形）; 30 ℃（圆形）; 40 ℃（正三角）; 50 ℃（倒三角）; 60 ℃（菱形）

3.7 底物浓度效应

较高的底物浓度有利于生物催化工艺的实际应用，因为它能在很大程度上提高产物的空时收率，降低产品分离成本[18]。因此，优化底物浓度，使某些酶的值最大化具有重要意义。在此研究了底物浓度对固定量酶（0.005 g/ml）产率和初始反应速率的影响。如图3所示，当底物浓度从42.4 mM提高到1.06 M时，产物生成率从41.2 mM显著提高到1.02 M，在42.4~211.9 mM范围内，初始反应速率与底物浓度成正比。通过进一步增加底物载量，没有观察到初始速率的下降，说明脂肪酶RMIM对高浓度的底物和产物都是耐受性的。

图3. 底物浓度对TMHQ-DA酯交换反应的影响。反应条件：TMHQ-DA：正丁醇（1：1），MTBE：正己烷（3:7）10ml，脂肪酶RM IM0.005g/ml，温度50 ℃，搅拌速度200 rpm。符号：42.4 mM（方形）；84.7 mM（圆形）；127.1 mM（正三角）；169.5mM（倒三角）；211.9 mM（菱形）；254.2 mM（左三角）；296.6 mM（右三角）；339.0 mM（六边形）；381.4 mM（五边形）；423.7 mM（+）；508.5 mM（）；635.6 mM（x）；762.7mM（*）；847.5 mM（）；1059.3 mM（|）

3.8 酶的可重用性

酶的可重用性是降低工业生产成本的另一个重要因素。在最佳反应条件下，对脂肪酶RM IM催化剂的稳定性进行了研究。为评价生物催化剂的可重用性，从有机溶剂中分离出脂质酶RM IM，经过滤后用正己烷洗涤两次，再重复使用。如图4所示，在重复使用20次之后，产品的产量仍然保持不变。直到第15次重复循环时，反应速率才开始下降。结果表明，脂酶RM IM在目前的体系中是相当稳定的，在TMHQ-1-MA生产中具有很大的实际应用潜力。

图4.生物催化剂可重复使用性对TMHQ-DA酯交换反应的影响。反应条件：TMHQ-DA 2.12 mmol，正丁醇2.12 mmol，MTBE：正己烷（3:7）10ml，脂肪酶RM IM 0.005 g / ml，温度50 ℃，搅拌速度200 rpm，反应时间3小时。符号：产率（方形）; 初始反应速率（圆形）

图5. 不同浓度正丁醇的Lineweaver-Burk双反演图。反应条件：MTBE：正己烷（3:7）10ml，脂肪酶 RMIM 0.005 g / ml，温度50 ℃，搅拌速度200 rpm。符号：55 mM（方形）; 45 mM（圆形）; 35 mM（正三角）; 25 mM（倒三角）

3.9 动力学研究

为了分析脂肪酶 RM IM催化TMHQ-DA与正丁醇酯交换的反应机理，在早期优化的参数下研究了底物（TMHQ-DA和正丁醇）浓度对初始反应速率的影响。图3显示了TMHQ-DA（A）的倒数速率与倒数浓度的Lineweaver-Burk图。当正丁醇（B）处于低浓度（25-55mM）时，初始反应速率增加随着正丁醇浓度的增加，达到最大值55 mM。因此，可以得出结论，正丁醇在25-55 mM范围内没有抑制。正如预期的那样，没有证据表明TMHQ-DA在任何与前一结论一致的浓度下都受到抑制。图5中给出的一系列没有共同交叉的平行线表明，TMHQ-DA和正丁醇的酯交换反应与乒乓双向机制相对应[10,19-23]。然而，正丁醇浓度的进一步增加（55 mM以上）导致初始反应速率下降，Lineweaver-Burk的反转曲线上升，数据未显示，这表明正丁醇含量较高浓度与酶反应形成死端抑制复合物。因此，排除了称为具有正丁醇抑制的乒乓双双机制的顺序机制。

方案2乒乓双向机制具有单底物抑制作用

通过脂肪酶催化酯交换反应来抑制酒精的经典乒乓双向机制的类比（方案2），假设TMHQ-DA [A]首先与游离酶[E]结合并形成非共价酶 - 底物复合物[EA]，释放出第一种产物和修饰酶[E']。第二种底物正丁醇[B]与E'反应得到复合物E'B，得到产物和游离酶[E]。与此同时，B还通过与游离酶[E]结合形成死端复合物[EiB]。具有酒精抑制作用的乒乓双双机制的速率方程式如下：

其中KmA是正丁醇的Michaelis常数，KmB是正丁醇的Michaelis常数，Ki是由正丁醇引起的抑制常数。v和vm分别是初始反应速率和最大反应速率。

为了验证乒乓双向机制的应用，使用软件包Polymath 6.0通过非线性回归分析相同的数据。由Polymath 6.0测定的动力学参数在表4中给出，其显示出优异的相关系数（数据未显示）。这表明所提出的脂肪酶RM IM催化TMHQ-DA和正丁醇的酯交换模型是有效的。

表4 具有正丁醇抑制作用的乒乓双向机制的动力学参数值

动力学参数	值
表观Vm（mW/min）	17.23
表观KmA（mW）	59.79
表观KmB（mW）	9.82
表观Ki（mW）	90.60

4 结论

本文研究开发出用于生产TMHQ-1-MA的新型生物催化方法。脂肪酶RM IM催化TMHQ-DA和正丁醇之间的区域选择性酯交换的最佳条件是在底物摩尔比为1:1，在50 ℃下在MTBE /正己烷中以200 rpm的搅拌速度实现的（3:7）。在上述条件下，底物负载量增加至1.06 M，产率为99％。此外，证明脂肪酶RM IM在20个循环后是活跃的。同时，基于初始速率数据和浓度分布，提出了一种称为乒乓双向机制的动力学模型，其具有正丁醇抑制作用。通过使用具有优异相关系数的非线性回归分析来评估动力学参数。

致谢

感谢浙江医药有限公司提供TMHQ-DA。本研究得到了中国浙江省自然科学基金（LQ13C010002、LY12B06010）的资助。

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原文标题：《Efficient synthesis ofvitamin E intermediate by lipase-catalyzed regioselective transesterification》

原文出处：Journal of MolecularCatalysis B: Enzymatic 106 (2014) 90–94.

涉及维生素E

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最后编辑时间为: 2020-05-08 08:31 Friday