2005年时，我曾经做过一个中成药的分析，当初是检测其中君药当归中的主成份阿魏酸含量。中成药组方分为君药、臣药、佐药和使药，测定含量时一般测定其中的君药含量即可。中成药组分复杂，一般由好几味药材组成，而一味药材中又有很多种组分。中成药相当于复方制剂（几十种成分），因此不像化药那样需要检查有关物质，无法检查。中成药含量测定的色谱图中，多种组分的色谱峰林立，主峰与相邻组分峰的分离可以说是见缝插针。该中成药中的君药含量测定，需要经过一系列的样品处理，索氏提取、氯仿萃取、挥干氯仿、溶剂复溶、过滤进样，这个过程一是为了提取主成分阿魏酸，二是为了除去其他药材组分以免干扰主成分测定。

进样后，发现色谱图中主峰附近有一杂峰挨得很近，应该算是肩峰，使得主峰无法准确积分。当初我还只是个助手，就跟着组长做实验。为了解决这个问题，她有两种方案，一是优化色谱条件改善分离，二是优化样品处理将这杂峰除去。优化色谱条件方面，经过一系列的改变流动相比例、更换色谱柱、调节柱温、甚至等度改成了梯度，该杂峰却始终与主峰形影相随，有分离迹像的也达不到基线分离。优化样品处理方面，样品重新处理了好几回，甚至尝试了将样品溶液过柱子，该杂峰依旧存在。

经过一番折腾后无果，组长甚是着急。我当时刚刚毕业两年，初生牛犊不怕虎，大学里曾经学过的分析化学还记忆犹新。这本分析化学教材是供药学类专业用，由孙毓庆老师主编的。目前药学专业的学生，应该还在用此教材吧，只是改版过了。其中在“高效液相色谱”章节中提到了用溶剂系统的四面体优化法来优化流动相。这部分内容有些复杂，在此我只作简单介绍，具体的大家如有兴趣可以再去回炉一下。该四面体由三个不同组别的纯溶剂（MEOH、CH3CN、THF）与底剂（H2O）组成正四面体。

四面体优化步骤为：

（1） 根据色谱类型（正、反相），按上述说明组成溶剂四面体，如下图；

（2） 寻找被分离组分的容量因子k≈3的等洗脱强度面ΔABC，如下图四面体中心的小三角形，在此面上的任一配比的溶剂洗脱强度都相等；

（3） 将此等洗脱面视为正三角形，按各个比例配制若干个二元、三元和四元初试溶剂；

（4） 用上述初试溶剂作流动相，进样，检查分离效果，从中择优选取。

这种四面体优化方法比较复杂，工作量大，实际工作中很少有这么干的，我们一般根据溶剂的洗脱强度因子，按照一定的比例去调节，这样操作简单。当然，近些年来计算机技术和软件技术的快速发展，据说可以通过简单几个实验就可以模拟筛选进行方法开发最终选出最优方法。上述是穿插的一些分析理论，言回上文案例。我当初对这些理论还有印象，于是在组长下班后就试着去尝试一下。原来的流动相是乙腈-缓冲溶液，我根据溶剂的洗脱能力在该流动相中添加了一定比例的甲醇并同时调节整个有机相比例，结果让人惊喜，主峰与杂峰完全达到了基线分离，而且保留时间跟以前基本一致，这样组分既分开了又没有改变分析时长。当然，分离是首要目标，不用过多关注分析时长，只要不离谱就行。这件事情，当初真让我小小激动了一把，有些成就感，又解了组长的燃眉之急，组长心里也高兴。此案例，正是利用提高流动相的选择性而改善分离。

这是一个化药缓释制剂，处方工艺开发接近尾声时，在溶出曲线日常检测过程中，发现一个棘手的事情。色谱条件是乙腈-pH2.0缓冲溶液，等度洗脱，色谱柱是某品牌的耐酸性色谱柱。每天溶出曲线样品量大，同时有四根这样的色谱柱投入使用，色谱柱使用了一年多基本保持较好的性能。但在这之后，短短一个月之内，这四根柱子先后“挂掉”，主峰与其后的辅料峰达不到基线分离，导致主峰无法准确积分。遂将这四根柱子冲洗再生，接上再试仍然分不开。查看柱效，的确较新启用时有较大的下降，因此判断色谱柱寿命差不多了该报废了。重新启用了两根新的同型号色谱柱，进样分析，分离度达3.5。但好景不长，这两根色谱柱竟然仅仅使用一周就不行了，主峰与其后辅料峰越来越近，到最后一半峰重叠了。主峰不能准确积分，大量样品的溶出数据不可靠，分析不能给制剂提供可靠的结果。制剂那边正在进行处方工艺的DOE，样品量大，而分析这边由于分离异常问题不能检测样品，再次请购色谱柱需要时间，再说即使新的色谱柱到货，我们也不能原因未查明的情况下贸然检测样品，毕竟这种色谱柱也好几千一根哪。大量样品积压，大家心里都是万分着急。

怎么办？当初我仔细比较了这后两根色谱柱和前面曾用过一年多的色谱柱，发现它们不是同一批的，因此我怀疑可能是这批色谱柱的填料有问题。优化色谱条件？当初真是十万个不情愿，因为这个方法是试行标准中的方法，且该项目都快交接工艺和转移分析方法了。尝试一下吧，眼前积压的样品正嗷嗷待哺呢。我仔细分析了一下这一个月前后的色谱图，发现虽然主峰与其后的辅料峰分离度在逐渐减小，但主峰的柱效基本保持与新柱一样较高的塔板数，柱效没变而分离度在下降，我猜测应该是色谱柱的选择性下降了。灵机一动，虽然固定相的选择性下降，但可以通过调节流动相的选择性来改善分离。因此，立刻在原来的流动相基础上加入一定比例的甲醇，同时调节整个有机相比例以维持主峰的保留时间。结果大快人心，主峰与其后的辅料峰的分离度达到了7.0，足足是新启用色谱柱的两倍多，而且保留时间与原来条件相差不多（溶出样品量大，分析时长要尽量简短才能高通量进样）。不光这样，而且那些用过一年多，柱效已经较低的四根“挂掉”的柱子在新条件下也能达到7.0的分离度，这些柱子又可以重新使用而不至于浪费。该方法后来经过大量样品的进样考验，分离度毫无减小的趋势。

上述两个案例都是充分利用了溶剂的选择性来改善分离，效果显著。在药典标准中，也有很多这样多组分混用的例子，比如USP中的卡培他滨，其中的杂质A和杂质B如不利用这个原理是相当难以分离的。正相色谱中也有好多这样例子，在此不再列举。薄层色谱中的展开剂也是利用溶剂的选择性来改善分离，让各物质斑点有不同的比移值而错开。那么，色谱分析中为何可以利用溶剂的选择性来改善分离呢，我们可以从色谱理论中的分离度方程来解析，这个方程在一般色谱书籍包括我们的分析化学教材里都能找到。下列方程一是分离度方程，从这个方程中，可以看到要提高分离度，主要是通过提高柱效n和选择性系数α以及容量因子k来实现。为了方便理解，将方程式转化成第二个方程，这样我们可以看出，如增大α，则1/α减小，1-1/α增大，分离度R增大。

本文通过亲身经历的两个经典案例，结合色谱分析理论，解析了利用溶剂的选择性来改善分离。这两个案例也让我真真切切地体会到液相色谱中溶剂选择性对分离的重要性，大家在实验时如碰到类似问题可以借鉴或有所启发。当然，甲醇或四氢呋喃的加入，一定会或多或少地增大基线噪音，但相对于收益来说可以忽略。基础理论让人感到晦涩难懂，但我们在实验中，还是要注意理论联系实际，用理论来武装自己，善于思考，那些疑难杂症或许就能迎刃而解。本文仅代表个人观点，如有不当之处，还望各位同仁多多包涵，亦或是抛砖引玉吧。