杏耀分红没到帐

巯基氨基酸是一类含有氨基、羧基和巯基的有机化合物的总称，包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（Gsh），是人体内必需的氨基酸之一，监测人体内巯基氨基酸的水平十分重要。由于Cys与Hcy等巯基氨基酸的结构非常相似，因此很难区分它们。目前报道的荧光探针能很好地识别Cys，但存在反应时间长、水溶性差、合成路线多等缺点。本文作者基于此设计并合成了一种水溶性的荧光探针J-L1，可在5秒内将Cys与Hcy和GSH区分开来。

J-L1具有与Cys反应的双反应位点（丙烯酸酯基和醛基）。将丙烯酸酯基引入荧光素骨架中可以实现荧光猝灭，而通过Cys与J-L1之间的快速反应去除丙烯酸酯部分可以恢复荧光。而五元噻唑烷基也可以通过Cys与醛基的反应形成。因此，探针J-L1可以通过这两种反应实现对Hcy和Gsh中Cys的选择性检测。

 

J-L1由荧光素衍生的醛1和丙烯酰氯制备。测试结果表明，与已经报道的荧光探针相比，该探针具有更好的水溶性、更快的响应时间和更低的检测限。J-L1在水中的稳定性良好，当pH值变化时，J-L1的荧光几乎没有变化，但添加巯基氨基酸后，所得体系的荧光显著增强，因此J-L1可作为巯基氨基酸的探针，且相关实验还证明J-L1可以通过荧光区分Cys、Hcy和Gsh。

 

首先进行了J-L1的Cys滴定实验。探针J-L1在HEPES缓冲液中几乎没有荧光，加入Cys后，混合物的荧光立即增强，呈强绿色，并伴随着从543nm到525nm的蓝移。加入120.0μm Cys后，混合物的荧光强度不再增强。

 

然后进行了UV-vis和荧光测试。在紫外光谱中，J-L1+Cys在485nm处出现一个强吸收峰（图a），在可见光照射下颜色从无色变为绿色（图b）。相比之下，J-L1对Hcy或GSH有轻微响应，对其他氨基酸几乎没有响应。同时，在荧光光谱中，J-L1对Cys的响应较强，而对Hcy或GSH的响应较弱（图c），Cys+J-L1的混合物荧光颜色呈现强烈的绿色荧光（图d）。因此，在可见光或紫外光照射下，J-L1探针仅凭肉眼就能分辨Cys和Hcy及Gsh。

作者还进行了荧光竞争实验来进一步验证J-L1对Cys的高选择性。在J-L1的HEPES缓冲液中加入其他氨基酸后，荧光强度略有增强或无增强。但当Cys单独添加到所有混合物中时，荧光显著增强。这表明，其它氨基酸对探针J-L1对Cys的识别没有明显影响。

 

通过一系列¹H NMR滴定实验来确定J-L1与Cys的反应机理。Ha、Hb和Hc属于J-L1中丙烯酸酯部分的质子信号，Hd属于醛基的质子信号（图a），这些信号在添加1.0eqCys后减弱（图b）。当添加12.0eqCys时，Ha、Hb、Hc和Hd的信号消失（图c）。这表明J-L1与Cys发生反应时形成化合物2。同时，混合物质谱中m/z 415.2452处的峰可归属于[J-L1+H]+，m/z 464.1135处的峰可归属于[2+H]+，m/z 177.0193处的峰可归属于七元内酰胺。因此，将Cys加入到J-L1溶液中首先发生共轭加成反应，随后形成内酰胺和荧光素衍生醛的“开环”形式。同时，另一个Cys与醛基之间也发生了环化反应。在HEPES缓冲液中525nm处的强荧光归因于化合物2的醌结构。与Hcy和Gsh相比，Cys能与J-L1反应形成良好的七元环，这是Cys区别于Hcy和Gsh的主要原因。

 

最后进行了荧光显微成像实验和一系列细胞实验。在HEPES缓冲液中用J-L1培养HeLa细胞，HeLa细胞在绿色通道中呈现弱荧光（图b）。在图d中，HeLa细胞内的内源性Cys被NEM保护，导致几乎没有荧光。用NEM处理HeLa细胞30min，分别用Cys（图f）、Hcy（图h）和Gsh（图j）在HEPES缓冲液中培养，再用J-L1培养2min，只有Cys细胞表现出强烈的绿色荧光，其余两组细胞几乎没有明显荧光。这表明J-L1能快速鉴别细胞内Cys，且具有良好的通透性。毒理学实验证明低浓度的J-L1探针对细胞几乎没有毒性，且J-L1在不受活细胞中常见离子干扰的情况下，能区分Cys。因此，J-L1可以在活细胞中实现Cys的快速检测。

DOI:10.1039/c9cc06468k

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最后编辑时间为: 2020-03-13 23:32 Friday